En af de vigtigste fordele ved cellekultur er evnen til at manipulere den fysiske kemi af celle-reproduktion (dvs. temperatur, pH, osmotisk tryk, O2- og CO2-spænding) og det fysiologiske miljø (dvs. hormon- og næringsstofkoncentration).Ud over temperatur styres kulturmiljøet af vækstmediet.
Selvom kulturens fysiologiske miljø ikke er så klart som dets fysiske og kemiske miljø, en bedre forståelse af serumkomponenter, identifikation af vækstfaktorer, der kræves for spredning, og en bedre forståelse af mikromiljøet af celler i kultur.(Dvs. celle-celle-interaktion, gasdiffusion, interaktion med matrixen) gør det nu muligt at dyrke visse cellelinjer i serumfrie medier.
1. Kulturmiljø påvirker cellevækst
Bemærk venligst, at cellekulturbetingelserne er forskellige for hver celletype.
Konsekvenserne af at afvige fra de dyrkningsbetingelser, der kræves for en bestemt celletype, spænder fra ekspression af unormale fænotyper til fuldstændig fiasko i cellekultur.Derfor anbefaler vi, at du bliver fortrolig med den cellelinje, du er interesseret i, og nøje følger instruktionerne for hvert produkt, du bruger i dit eksperiment.
2. Forholdsregler for at skabe et optimeret cellekulturmiljø for dine celler:
Kulturmedier og serum (se nedenfor for mere information)
pH- og CO2-niveauer (se nedenfor for mere information)
Dyrk plastik (se nedenfor for mere information)
Temperatur (se nedenfor for mere information)
2.1 Kulturelle medier og serum
Dyrkningsmediet er den vigtigste del af kulturmiljøet, fordi det giver de næringsstoffer, vækstfaktorer og hormoner, der er nødvendige for cellevækst, og regulerer kulturens pH og osmotiske tryk.
Selvom de indledende cellekultureksperimenter blev udført ved hjælp af naturlige medier opnået fra vævsekstrakter og kropsvæsker, førte behovet for standardisering, mediekvalitet og øget efterspørgsel til udviklingen af definitive medier.De tre grundlæggende typer medier er basalmedier, reducerede serummedier og serumfrie medier, og de har forskellige krav til serumtilskud.
2.1.1 Grundmedie
Gibco cellekulturmedium
De fleste cellelinjer vokser godt i basiske medier, der indeholder aminosyrer, vitaminer, uorganiske salte og kulstofkilder (såsom glucose), men disse basismedieformuleringer skal suppleres med serum.
2.1.2 Reduceret serummedium
Flaske med Gibco Low Serum Medium
En anden strategi til at reducere de negative virkninger af serum i cellekultureksperimenter er at bruge serumreducerede medier.Reduceret serummedium er en basisformel rig på næringsstoffer og animalske faktorer, som kan reducere den nødvendige mængde serum.
2.1.3 Serumfrit medium
Flaske med Gibco serumfrit medium
Serumfrit medium (SFM) omgår brugen af animalsk serum ved at erstatte serum med passende ernærings- og hormonformuleringer.Mange primære kulturer og cellelinjer har serumfrie mediumformuleringer, herunder den kinesiske hamster-ovarie (CHO) rekombinante proteinproduktionslinje, forskellige hybridomcellelinjer, insektlinjer Sf9 og Sf21 (Spodoptera frugiperda) samt for værten til virusproduktion (f.eks. 293, VERO, MDCK, MDBK) osv. En af hovedfordelene ved at bruge et serumfrit medium er evnen til at gøre mediet selektivt for specifikke celletyper ved at vælge en passende kombination af vækstfaktorer.Følgende tabel viser fordele og ulemper ved serumfri medier.
Fordel
Øg klarheden
Mere ensartet ydeevne
Lettere oprensning og nedstrøms forarbejdning
Nøjagtigt vurdere cellefunktion
Øg produktiviteten
Bedre kontrol med fysiologiske reaktioner
Forbedret cellemediedetektion
Ulempe
Celletypespecifikke medieformelkrav
Har brug for højere reagensrenhed
Opbremsning i væksten
2.2.1 pH-niveau
De fleste normale pattedyrcellelinjer vokser godt ved pH 7,4, og forskellene mellem forskellige cellelinjer er små.Nogle transformerede cellelinjer har dog vist sig at vokse bedre i et let surt miljø (pH 7,0 – 7,4), mens nogle normale fibroblastcellelinjer foretrækker et let alkalisk miljø (pH 7,4 – 7,7).Insektcellelinjer såsom Sf9 og Sf21 vokser bedst ved pH 6,2.
2.2.2 CO2-niveau
Vækstmediet kontrollerer kulturens pH og buffer cellerne i kulturen for at modstå ændringer i pH.Normalt opnås denne buffering ved at indeholde organiske (for eksempel HEPES) eller CO2-bicarbonatbaserede buffere.Fordi mediets pH afhænger af den delikate balance mellem opløst kuldioxid (CO2) og bikarbonat (HCO3-), vil ændringer i atmosfærisk CO2 ændre mediets pH.Når man bruger et medium bufret med en CO2-bicarbonatbaseret buffer, er det derfor nødvendigt at anvende eksogen CO2, især når man dyrker celler i åbne kulturskåle eller dyrker transformerede cellelinjer i høje koncentrationer.Selvom de fleste forskere normalt bruger 5-7 % CO2 i luften, bruger de fleste cellekulturforsøg normalt 4-10 % CO2.Hvert medium har dog en anbefalet CO2-spænding og bikarbonatkoncentration for at opnå den korrekte pH-værdi og det osmotiske tryk;For mere information henvises til medieproducentens instruktioner.
2.3 Dyrkning af plast
Cellekulturplast fås i en række forskellige former, størrelser og overflader, der passer til forskellige cellekulturapplikationer.Brug cellekulturplastikoverfladeguiden og cellekulturbeholderguiden nedenfor for at hjælpe dig med at vælge den rigtige plastik til din cellekulturapplikation.
Se alt Thermo Scientific Nunc cellekulturplast (annoncelink)
2.4 Temperatur
Den optimale temperatur for cellekultur afhænger i høj grad af kropstemperaturen for den vært, hvorfra cellerne er isoleret, og i mindre grad af de anatomiske temperaturændringer (f.eks. kan hudtemperaturen være lavere end skeletmuskulaturen) ).For cellekultur er overophedning et mere alvorligt problem end overophedning.Derfor er temperaturen i inkubatoren normalt sat lidt under den optimale temperatur.
2.4.1 Optimal temperatur for forskellige cellelinjer
De fleste humane og pattedyrcellelinjer holdes ved 36°C til 37°C for optimal vækst.
Insektceller dyrkes ved 27°C for optimal vækst;de vokser langsommere ved lavere temperaturer og temperaturer mellem 27°C og 30°C.Over 30°C falder insektcellernes vitalitet, selvom den vender tilbage til 27°C, vil cellerne ikke komme sig.
Fuglecellelinjer har brug for 38,5°C for at nå maksimal vækst.Selvom disse celler kan holdes ved 37°C, vil de vokse langsommere.
Cellelinjer afledt af koldblodede dyr (såsom padder, koldtvandsfisk) kan tåle et bredt temperaturområde på 15°C til 26°C.
Indlægstid: 01-02-2023