Kontaminering af cellekulturer kan let blive det mest almindelige problem i cellekulturlaboratorier, hvilket nogle gange kan forårsage meget alvorlige konsekvenser.Cellekulturkontaminanter kan opdeles i to kategorier, kemiske kontaminanter såsom medium-, serum- og vandurenheder, endotoksiner, blødgøringsmidler og detergenter og biologiske kontaminanter såsom bakterier, skimmelsvampe, gær, vira, krydsinfektion med mycoplasmas.Forurenet af andre cellelinjer.Selvom det er umuligt helt at eliminere forurening, kan dens hyppighed og sværhedsgrad reduceres ved grundigt at forstå dens kilde og følge gode aseptiske teknikker
1. Dette afsnit skitserer hovedtyperne af biologisk forurening:
Bakteriel forurening
Skimmelsvamp og viruskontaminering
Mycoplasma forurening
Gærforurening
1.1 Bakteriel forurening
Bakterier er en stor gruppe af allestedsnærværende encellede mikroorganismer.De er normalt kun et par mikrometer i diameter og kan komme i en række forskellige former, fra kugler til stænger og spiraler.På grund af deres allestedsnærværende, størrelse og hurtige væksthastighed er bakterier sammen med gær og skimmelsvampe de mest almindelige biologiske kontaminanter i cellekultur.
1.1.1 Påvisning af bakteriel kontaminering
Bakteriel kontaminering opdages let ved visuel inspektion af kulturen inden for et par dage efter, at den er blevet inficeret;
Inficerede kulturer fremstår sædvanligvis uklare (dvs. uklare), nogle gange med en tynd film på overfladen.
Pludselige fald i dyrkningsmediets pH-værdi er også hyppigt stødt på.
Under et laveffektmikroskop fremstår bakterierne som små, bevægelige granulat mellem cellerne, og observation under et højeffektmikroskop kan løse individuelle bakteriers former.
1.2 Skimmelsvamp og viruskontamination
1.2.1 Skimmelsvampforurening
Skimmelsvampe er eukaryote mikroorganismer fra svamperiget, der vokser i form af flercellede filamenter kaldet hyfer.Forbindelsesnetværkene af disse flercellede filamenter indeholder genetisk identiske kerner kaldet kolonier eller mycelium.
I lighed med gærkontaminering forbliver kulturens pH stabil under den indledende fase af kontamineringen og stiger derefter hurtigt, efterhånden som kulturen bliver mere alvorligt inficeret og bliver uklar.Under mikroskopet er myceliet sædvanligvis filamentøst, nogle gange som tætte klynger af sporer.Sporerne fra mange skimmelsvampe kan overleve i ekstremt barske og ugæstfrie omgivelser under deres hvilefase og aktiveres kun, når de rette vækstbetingelser er mødt.
1.2.2 Viruskontaminering
Vira er mikroskopiske infektionsstoffer, der overtager værtscellens maskineri til reproduktion.Deres ekstremt lille størrelse gør dem vanskelige at påvise i kultur og at fjerne fra reagenser, der bruges i cellekulturlaboratorier.Da de fleste vira har meget strenge krav til deres værter, påvirker de normalt ikke cellekulturer af andre arter end værten negativt.
Brugen af virusinficerede cellekulturer kan dog udgøre en alvorlig risiko for laboratoriepersonalets helbred, især hvis der dyrkes humane eller primatceller i laboratoriet.
Viral infektion i cellekulturer kan påvises ved elektronmikroskopi, immunfarvning med et sæt antistoffer, ELISA eller PCR med passende virale primere.
1.3 Mycoplasma-kontamination
Mycoplasmas er simple bakterier uden cellevægge, og de menes at være de mindste selvreplikerende organismer.På grund af deres ekstremt lille størrelse (normalt mindre end 1 mikron) er mycoplasma vanskelig at opdage, indtil de når ekstremt høje tætheder og får cellekulturer til at forringes;Indtil da er der normalt ingen tydelige tegn på infektion.
1.3.1 Påvisning af mycoplasma-kontamination
Nogle langsomt voksende mycoplasmaer kan fortsætte i kulturer uden at forårsage celledød, men de ændrer adfærd og metabolisme af værtsceller i kulturer.
Kronisk mycoplasmainfektion kan karakteriseres ved reduceret celleproliferationshastighed, nedsat mætningsdensitet og agglutination i suspensionskultur.
Den eneste pålidelige måde at detektere mycoplasma-kontamination på er dog at teste kulturen regelmæssigt ved hjælp af fluorescerende farvning (f.eks. Hoechst 33258), ELISA, PCR, immunfarvning, autoradiografi eller mikrobiel testning.
1.4 Gærkontamination
Gær er encellede eukaryoter af svamperiget, der varierer i størrelse fra nogle få mikron (normalt) til 40 mikron (sjældent).
1.4.1 Påvisning af gærforurening
Som med bakteriel forurening kan kulturer, der er forurenet med gær, blive uklare, især hvis forureningen er i et fremskredent stadium.pH-værdien af kulturer, der er forurenet med gær, ændres meget lidt, indtil forureningen bliver mere alvorlig, på hvilket tidspunkt pH-værdien normalt stiger.Under mikroskopet fremstår gær som individuelle ægformede eller sfæriske partikler og kan producere mindre partikler.
2. Krydsinfektion
Selvom det ikke er så almindeligt som mikrobiel kontaminering, er omfattende krydskontaminering af mange cellelinjer med HeLa og andre hurtigtvoksende cellelinjer et klart defineret problem med alvorlige konsekvenser.Få cellelinjer fra velrenommerede cellebanker, kontroller regelmæssigt cellelinjernes egenskaber og brug gode aseptiske teknikker.Denne praksis vil hjælpe dig med at undgå krydskontaminering.DNA-fingeraftryk, karyotyping og isotyping kan bekræfte, om der er krydskontaminering i din cellekultur.
Selvom det ikke er så almindeligt som mikrobiel kontaminering, er omfattende krydskontaminering af mange cellelinjer med HeLa og andre hurtigtvoksende cellelinjer et klart defineret problem med alvorlige konsekvenser.Få cellelinjer fra velrenommerede cellebanker, kontroller regelmæssigt cellelinjernes egenskaber og brug gode aseptiske teknikker.Denne praksis vil hjælpe dig med at undgå krydskontaminering.DNA-fingeraftryk, karyotyping og isotyping kan bekræfte, om der er krydskontaminering i din cellekultur.
Indlægstid: 01-02-2023